¿Qué es una recombinación del VIH?

La recombinación genética forma parte del mecanismo normal de replicación de los retrovirus y como tal juega un papel importante en la generación de la diversidad de estos virus. La generación de retrovirus recombinantes requiere que dos virus infecten una célula, bien simultáneamente a través de un episodio único de transmisión, como de forma secuencial, en varios episodios.

En el VIH-1, la recombinación se puede producir entre diferentes cepas del mismo subtipo (intra-subtipo), distintos subtipos (inter-subtipo) o diferentes grupos (inter-grupo).

MECANISMOS MOLECULARES DE RECOMBINACIÓN EN VIH-1

Los retrovirus, así como otros virus ARN, presentan tasas altas de mutación debido a la falta de actividad correctora en las polimerasas virales, a sus cortos ciclos replicativos y a sus grandes tamaños poblacionales.

En consecuencia, en el organismo hospedador estos virus están presentes como mezclas de poblaciones genéticamente diferentes, pero relacionadas entre sí, denominadas cuasiespecies.

Éstas representan a todos los posibles mutantes, prueba de ello es la presencia de mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos antirretrovirales en pacientes que no han recibido tratamiento, lo que se denomina "resistencia natural".

Los retrovirus además son conocidos por su elevado potencial de recombinación, debido a que la recombinación constituye una parte intrínseca de su ciclo replicativo normal. El mecanismo de recombinación sirve para mediar la reparación de genomas retrovirales defectivos, para incrementar la diversidad viral, y para acelerar la propagación de mutaciones ventajosas entre las cuasiespecies virales.

El potencial incremento de variabilidad mediado por la recombinación confiere a los retrovirus capacidad para responder rápidamente a cambios de presión selectiva, bien sea inmunológica o farmacológica, mediante la rápida generación de las variantes más aptas para eludir esas presiones, al albergar el conjunto de mutaciones más adecuado.

La recombinación en los retrovirus requiere de la coencapsidación en cada virión de dos ARN genómicos. La recombinación entre genomas encapsidados en dos viriones diferentes es posible solamente mediante la infección productiva de una única célula por ambos viriones, lo que permite la generación de partículas heterocigotas.

En un posterior ciclo infectivo, puede generarse un genoma recombinante mediante saltos alternativos de la TI entre ambos genomas coencapsidados.

La síntesis de ADN proviral de doble hebra por la transcriptasa inversa (TI) requiere de dos saltos obligatorios entre los ARNs molde, necesarios para la duplicación de las secuencias repetidas terminales largas (LTR) presentes en ambos extremos del genoma(revisado en. En el primer salto, la hebra de ADN de polaridad negativa denominada "de parada brusca" (strong-stop DNA), cuya síntesis se inicia en el ARNt hibridado al sitio de unión del primer (primer-binding site), se trasloca desde el extremo 5’ al 3’ del genoma.

Este salto es posible por la presencia de secuencias repetidas en ambos extremos del genoma, y puede ser intermolecular o intramolecular. El segundo salto consiste en la traslocación de la hebra de ADN de polaridad positiva, cuya síntesis se inicia en el tracto polipurínico, desde el extremo 3’ al 5’ del genoma. Este salto es mediado por el emparejamiento de bases del sitio de unión del primer de la hebra del ADN positivo (generado por la copia del extremo 3’ del ARNt unido covalentemente a la hebra negativa de ADN) a su secuencia complementaria en el ADN de polaridad negativa, y es siempre intramolecular.

Además de los saltos obligatorios del ADN, pueden ocurrir saltos de la TI entre hebras de ARN en regiones internas del genoma, que en viriones heterocigotos generarían un genoma recombinante. En VIH-1, se ha descrito recientemente que en cada ciclo replicativo, se producen como promedio nueve saltos entre moldes de ARN en linfocitos T en cultivo, y 30 en macrófagos, frecuencias mucho más altas de las descritas previamente.

La evidencia experimental indica que los saltos entre hebras ocurren predominantemente, si no exclusivamente, durante la síntesis de la hebra negativa de ADN. En el modelo de elección de copia forzado (forced copy-choice), las roturas en el ARN obligarían a la TI a cambiar de ARN molde, restaurando así la continuidad del genoma para generar una progenie viable. Un modelo relacionado propone que la baja procesividad de la TI viral daría lugar a pausas durante la polimerización del ADN dependiente de ARN, lo que promovería el cambio de molde sin la necesidad de roturas.

En conformidad con este modelo, los estudios in vitro indican que las pausas en la polimerización aumentan la frecuencia del cambio de molde. Durante las pausas, que pueden estar favorecidas por estructuras secundarias de ARN, incorporaciones incorrectas de nucleótidos o bajas concentraciones de dNTPs, aumenta la degradación mediada por RNasa H del molde original (donante) de ARN subyacente a la TI detenida.

Este proceso genera un segmento de ADN de hebra única más largo, que quedaría libre para hibridar con la hebra de ARN opuesta (aceptora), posicionándola cerca del sitio activo de la polimerasa, facilitando así el cambio de molde.

En contraposición con este modelo, otros autores postulan que las transferencias independientes de pausa podrían ser las predominantes, las cuales podrían ser favorecidas por la proximidad entre hebras mediada por interacciones entre estructuras secundarias.

La frecuencia de recombinación también puede ser altamente dependiente de la similitud de secuencias. En un estudio, con una diferencia de secuencias igual o mayor al 25%, la recombinación en VIH-1 dependiente de homología de secuencias no era mayor que la independiente de homología.

Existen múltiples métodos disponibles para el análisis de secuencias recombinantes. Las que se han usado con mayor frecuencia en VIH-1 son gráficas de similitud o diversidad de secuencias y el "bootscanning". Puede obtenerse una localización más precisa de los puntos de recombinación mediante el análisis de sitios informativos.

Una forma recombinante intersubtipo se identifica cuando sus relaciones filogenéticas con distintos subtipos cambian a lo largo del genoma. La recombinación intrasubtipo es difícil de detectar, a menos que se identifiquen los virus parentales, o que éstos agrupen en distintos grupos filogenéticos conocidos. Para una caracterización completa de la estructura en mosaico, es necesario el análisis del genoma completo. Una alternativa más práctica para un número mayor de muestras es analizar segmentos parciales situados en regiones separadas del genoma. Frecuentemente se han usado segmentos de gag y env (principalmente el bucle V3) o de pol y env para análisis filogenéticos.

FORMAS RECOMBINANTES DE VIH-1 EN LA PANDEMIA GLOBAL

En 1988 ya se sugirió la existencia de recombinación en un virus VIH-1 aislado de un individuo infectado, el aislado africano MAL. Sin embargo, el reconocimiento de la importancia de la recombinación en la conformación de la diversidad del VIH-1 en la pandemia global es un avance relativamente reciente. En un principio, la clasificación del VIH-1 en diferentes subtipos genéticos estuvo basada en los agrupamientos de secuencias de env y gag en árboles filogenéticos, identificando así, en estos primeros estudios, a cinco de los nueve subtipos reconocidos hasta el momento.

El primer caso publicado de recombinación intersubtipo en individuos infectados se describió en Brasil en 1994 en una pareja sexual en la que ambos estaban infectados con un virus recombinante BF. Al año siguiente, se detectó una elevada frecuencia (10%) de virus recombiantes intersubtipo en las secuencias depositadas en bases de datos.

En 1996, el análisis de genomas completos de aislados de una forma genética circulante en Tailandia y en África Central reveló que se trataba de una forma recombinante intersubtipo, que se designaría más tarde CRF01_AE. Previamente, ya se había sugerido su origen recombinante tras analizar secuencias parciales.

En 1988, la segunda CRF (un recombinante AG) fue identificada por análisis de secuencias de genomas completos de virus de Nigeria y Yibuti. Publicaciones posteriores apuntan que esta CRF (actualmente designada CRF02_AG) es la variante circulante de VIH-1 más extendida en África occidental y en algunos países de África central occidental.

La nomenclatura actual de CRFs y los criterios para definirlas se adoptó en 1999. Según estos criterios, para definir una CRF, se deben caracterizar tres virus sin relación epidemiológica entre ellos, con idénticos patrones de recombinación y agrupación consistente en árboles filogenéticos, secuenciándose al menos dos genomas completos (>8 kb). Las CRFs se van designando con números consecutivos a medida que se van describiendo, seguido por los subtipos parentales, o cpx (del inglés complex, complejo) cuando derivan de más de dos subtipos parentales.

Actualmente se han identificado 19 CRFs: 12 originadas en África, tres en Asia, dos en Europa, y dos en América. Las de mayor importancia epidemiológica, que representan las formas genéticas de VIH-1 más prevalentes en determinadas áreas, son: CRF01_AE en el sureste de Asia, CRF02_AG en África occidental y central-occidental, CRF03_AB en Kaliningrado (Rusia), CRF07_BC y CRF08_BC en China, y CRF12_BF y recombinantes relacionados en Argentina y Uruguay.

En un estudio reciente sobre la distribución global de formas genéticas de VIH-1, el 18% de las muestras de infecciones analizadas correspondían a virus recombinantes. Globalmente, las formas recombinantes más prevalentes son CRF02_AG (que causa el 31% de las infecciones en África Occidental) y CRF01_AE (que representa el 63% de las infecciones en sureste de Asia y el 24% en Asia Oriental y Pacífico).

AVANCES RECIENTES EN LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LAS FORMAS RECOMBINANTES DE VIH-1

Los últimos avances relacionados con formas recombinantes en los últimos cuatro años incluyen la descripción de 11 nuevas formas recombinantes circulantes, el reconocimiento de la expansión geográfica en nuevas áreas de CRFs previamente identificadas, el hallazgo de elevadas frecuencias de URFs en áreas donde múltiples formas genéticas cocirculan, y la primera documentación de superinfección con VIH-1 en humanos.

CRFs identificadas recientemente

La CRF12_BF fué identificada en Argentina y Uruguay.

Previamente, se había propuesto su existencia en un estudio en el que se encontraba una amplia circulación de virus recombinantes BF en Argentina, en los que la coincidencia de la localización de puntos de recombinación en pol sugería un ancestro común.

Uno de los hallazgos más notables en Argentina y Uruguay, revelado por el análisis de genomas completos, es que las URFs relacionadas con CRF12_BF, la mayoría aparentemente derivadas de recombinaciones secundarias con virus de subtipo B, parecen ser más prevalentes que la propia CRF12_BF.

Se ha propuesto que CRF12_BF podría haberse originado en Brasil. Esta hipótesis deriva de dos hechos: el no haberse hallado virus de subtipo F no recombinantes en Argentina o Uruguay y la relación filogenética de los fragmentos F de CRF12_BF con virus de subtipo F de Brasil. Sin embargo, no se han encontrado virus CRF12_BF en Brasil, lo que indicaría que estos recombinantes no circulan o son minoritarios en este país.

De acuerdo con las fechas de infección y las distancias genéticas, CRF12_BF es la CRF más antigua que se ha originado fuera de África. La CRF12_BF y los recombinantes relacionados con la misma representan el 65% de las infecciones en Argentina, y además han sido identificados en Bolivia, Chile, Venezuela y España.

La CRF14_BG ha sido identificada en Galicia, circulando en una minoría de usuarios de drogas por vía intravenosa (UDIs), y representa la primera CRF originada en Europa Occidental que se caracteriza. Esta CRF también circula en Portugal.

Además se han identificado virus de subtipo G que circulan en Galicia y Portugal como parentales de CRF14_BG. Al igual que los hallazgos en Argentina, aunque a menor escala, hemos encontrado una serie de URFs derivados de recombinaciones secundarias de CRF14_BG con virus de subtipo B.

La CRF06_cpx, previamente caracterizada en dos únicos aislados, actualmente cumple los requisitos para ser reconocido como CRF al haberse caracterizado el genoma completo de dos nuevos aislados. Un reanálisis de su patrón de recombinación indica que se trata de un recombinante entre los subtipos A, G, J y K. El análisis de virus caracterizados en secuencias parciales apunta hacia una amplia distribución geográfica de la CRF06_cpx en África occidental.

En Níger, los virus CRF06_cpx representan el 18% de las infecciones con VIH-1, según un estudio reciente. Además, virus CRF06_cpx parecen haberse expandido recientemente entre UDIs en Estonia. La CRF11_cpx, un recombinante A/G/J/E, ha sido identificado en África central por análisis de secuencias completas de cuatro virus de Camerún y de la República centroafricana. Su patrón de recombinación coincide con la de un virus previamente caracterizado de la República Democrática del Congo.

Los análisis de secuencias parciales sugieren la presencia de CRF11_cpx en Senegal y Gabón. La existencia de otra CRF compleja en Camerún, la CRF13_cpx, derivada de los mismos subtipos parentales, pero difiriendo de CRF11_cpx en su estructura, ha sido propuesta en base a dos genomas completos de dos aislados no relacionados epidemiológicamente entre sí.

Se han descrito dos nuevas CRFs en Cuba. La CRF18_cpx, detectada en 7% de las muestras cubanas, es un recombinante complejo entre subtipos A, F, G, H, K y uno o más subtipos desconocidos, y la CRF19_cpx, detectada en el 21% de las muestras, es recombinante entre subtipos A, D y G. El origen de ambas es muy probablemente africano, porque no se han hallado en Cuba los virus parentales. De hecho, un recombinante complejo de Camerún (CM53379)(71), cuyo genoma está completamente secuenciado, pertenece a la CRF18_cpx.

Otras CRFs minoritarias descritas recientemente son la CRF09_cpx, detectada en África occidental y Camerún, la CRF15_01B (recombinante entre CRF01_AE y subtipo B), en Tailandia, la CRF16_A2D en muestras de Kenia, Corea y Argentina, y la CRF17_BF en varios países de Sudamérica.

Han sido identificados virus recombinantes filogenéticamente relacionados con el aislado MAL, de África central, que fue el primer virus recombinante caracterizado, en Noruega, España, Reino Unido Cuba, y Gabón(, lo que sugiere la existencia de una CRF relacionada con MAL.

Alta frecuencia de URFs

Algunos estudios genéticos han descrito frecuencias altas de URFs en África occidental (Nigeria y Níger, África central occidental (República Democrática del Congo, Camerún, Gabón y Angola, África oriental (Tanzania, Kenia y Uganda), América del Sur (Argentina, Uruguay y Brasil), Caribe (Cuba), Asia (Myanmar, China y Tailandia), y en Europa occidental (Galicia, Portugal y Reino Unido). En el Camerún rural, seis (27%) de 22 virus caracterizados en genoma completo eran URFs.

En África Oriental, el análisis de genomas completos reveló que las URFs constituyen más de la mitad (cinco de nueve) de los aislados en Tanzania, el 39% en Kenia, y el 30% en Uganda, derivados de subtipos que circulan en cada uno de estos países.

En Argentina, 17 (77%) de los 22 virus recombinantes BF analizados en el genoma completo, fueron URFs, relacionados con CRF12_BF, pero diferentes a ésta (Figura 3a). En Río de Janeiro (Brasil), el análisis de ocho genomas completos de virus que en secuencias parciales eran de subtipo F o recombinantes BF reveló que todos ellos eran recombinantes BF únicos, sin relación entre sí ni con la CRF12_BF. En Cuba, el análisis de secuencias parciales de pol y env reveló que 14 (13%) de 105 muestras eran URFs resultantes de la recombinación de cuatro formas genéticas circulantes en la isla (subtipos B y G, y recombinantes Dpol/Aenv y Upol/Henv, estas últimas identificadas recientemente como CRF19_cpx y CRF18_cpx)(69,70).

En Asia se han registrado altas frecuencias de URFs en el centro de Myanmar(90) y en la provincia china de Yunnan donde el 71% de los virus de la prefectura de Dehong fueron formas recombinantes BC. En Galicia, entre los virus de subtipo no B, el análisis de secuencias parciales de pol y env indica que el 72% (49 de 68) de los virus eran recombinantes, 20 de los cuales (41%) eran URFs. Entre éstos, los más comunes eran recombinantes BG, originados por la recombinación de virus de subtipo G o CRF14_BG con virus de subtipo B. En Reino Unido, el 20% de las infecciones con subtipos no B corresponden a virus recombinantes, de los cuales el 72% no pertenecen a ninguna de las CRFs descritas. La distribución geográfica de CRFs y URFs se resume en la Tabla 1.

Por lo tanto, los hallazgos recientes resaltan la importancia de la recombinación como uno de los principales, tal vez el más importante de los mecanismos generadores de diversidad viral en la pandemia global del VIH-1. Probablemente, la prevalencia real de URFs está subestimada en los estudios basados en análisis de secuencias parciales. Sólo en unos pocos países se ha analizado un número relativamente grande de secuencias de genomas completos, pero incluso en dichos países el número dista de ser representativo.

En cualquier caso, la alta prevalencia de URFs en muchas áreas muestra que es bastante común la infección dual con diferentes formas genéticas. Se desconoce la proporción en que dichas infecciones derivan de infecciones simultáneas o próximas cronológicamente, o de reinfecciones en infecciones previamente establecidas y con respuesta inmune madura.

La prevalencia de la recombinación entre virus VIH-1 de la misma forma genética (recombinantes intrasubtipo) es desconocida debido a la dificultad para su identificación. Sólo es posible su detección cuando se caracterizan los virus parentales, o cuando la recombinación ocurre entre virus con diferente agrupamiento filogenético que circulan en una misma área geográfica, tal como ocurre en Etiopía. Además de este país, se ha documentado la cocirculación de virus de un mismo subtipo pero distinguibles filogenéticamente en Brasil (subtipo B), Cuba (subtipo B) y Portugal (subtipo G), países en los que podría analizarse la recombinación intrasubtipo.

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS

El bucle V3 de la gp120 del VIH-1, es el determinante principal del tropismo, del fenotipo inductor de sincitios (IS) y del uso de correceptores (Figura 5). Los virus con fenotipo IS utilizan el correceptor CXCR4 de forma individual o junto con el CCR5, mientras que los virus con fenotipo no inductor de sincitios (NIS) utilizan el correceptor CCR5. Se ha demostrado que la presencia de aminoácidos con carga positiva en las posiciones 11 y/o 25 de la región V3 se relaciona con el uso del correceptor CXCR4 y el fenotipo IS, mientras que la presencia de aminoácidos con carga neutra o negativa serían predictivos del uso de CCR5 y fenotipo NIS. Hay diferentes estudios que sugieren también que las substituciones básicas múltiples dentro del bucle V3 asociadas a una carga neta positiva alta (superior a +4), aun en ausencia de las substituciones en posiciones 11 y 25, pueden ser también predictivos del uso de CXCR4 y fenotipo IS.

En concreto, la carga neta del bucle V3, basada en la diferencia entre el número de aminoácidos con carga positiva, arginina (R) o lisina (K), y el número con carga negativa, ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) puede resultar también de un importante valor predictivo del uso de correceptores y fenotipo IS.

Esta asociación se ha demostrado en las cepas de VIH-1 de subtipo A, B, C, D, E (CRF01_AE) y G, aunque se han descrito ciertas diferencias en algunos subtipos. En este sentido, se ha publicado la ausencia de correlación entre la presencia de aminoácidos cargados positivamente y el fenotipo IS en cepas de subtipo F, así como la presencia de un alto número de substituciones con carga positiva entre cepas de subtipo D.

También se ha descrito que los virus del subtipo C tienen una frecuencia más baja de fenotipo IS en pacientes con SIDA, habiéndose demostrado, sin embargo, la presencia de cepas IS en pacientes con infección reciente y el uso del correceptor CXCR4 en 5 de 29 pacientes infectados por subtipo C.

No existe mucha información sobre las características biológicas de formas recombinantes de VIH-1 aisladas a partir de células mononucleares de sangre periférica o fluidos orgánicos. Se han descrito características biológicas similares a las de subtipo B, en virus correspondientes a la CRF02_AG, obtenidos a partir de pacientes de Camerún, guardando también relación con el estadío clínico de los pacientes.

Hemos descrito las características biológicas de diferentes aislados de la CRF14-BG que está circulando en Galicia entre pacientes usuarios de drogas intravenosas, resultando en todos los casos con fenotipo IS, uso de CCR2b, CCR3, CCR5 y CXCR4, carga neta positiva alta e independiente del estadío clínico de la enfermedad, demostrando también la presencia de una serie de mutaciones características en el bucle V3.

Estos hallazgos plantean la necesidad de establecer si la correlación entre fenotipo viral y progresión de la infección es similar o no a la descrita en cepas de subtipo B. Se ha descrito un predominio del fenotipo no inductor de sincitios y el uso del correceptor CCR5 basado en la secuencia de V3 de diferentes formas recombinantes detectadas en Galicia. El uso preferencial de CCR5 podría favorecer la transmisión de estas formas recombinantes entre pacientes con relaciones heterosexuales.

El cambio del uso de correceptores de CCR5 a CXCR4 y de fenotipo NIS a fenotipo IS, se relaciona con la evolución de la infección, observándose que en aproximadamente el 50% de los pacientes con SIDA se aíslan virus que utilizan CXCR4 y son inductores de sincitios. Se ha descrito este cambio en 143 aislados de VIH-1 de subtipo A, B, C y D y un recombinante (CRF01_AE), de 24 niños infectados por transmisión vertical, detectándose una asociación significativa entre la disminución en la cifra de linfocitos T CD4+ y evolución de la enfermedad y de cepas que utilizan CXCR4.

A pesar de la gran variabilidad del bucle V3, los tres aminoácidos Gly217-Pro318-Gly319 situados en el centro del bucle constituyen una región conservada e implicada en el cambio conformacional que se requiere para la inducción de sincitios y para la apoptosis. Sin embargo, se han descrito algunos cambios inusuales en dicha secuencia GPG correspondiente a subtipos no-B. Se ha demostrado la secuencia GVGR en un subtipo F procedente de un paciente de Rumanía, así como la secuencia GIGK en un subtipo C. En otro estudio, casi el 40% de los aislados de subtipo B procedentes de Brasil, presentaban la secuencia GWGR. En nuestro laboratorio hemos detectado también una secuencia inusual, GRGR, en clones biológicos de subtipo B procedentes de un paciente con infección doble G+B. El efecto de mutaciones puntuales en esta secuencia GPG del bucle V3 puede también repercutir en el tropismo del virus por macrófagos y células derivadas del sistema nervioso central.

La recombinación entre diferentes formas genéticas puede conllevar cambios en las propiedades biológicas de los virus implicados en la recombinación. Estos cambios pueden ser diferentes dependiendo de la caracterización biológica y genética de ambos virus, habiéndose demostrado una interacción molecular y biológica entre dos cepas de subtipo B procedentes de un paciente con una coinfección por ambas cepas, y sugiriendo el papel del sinergismo viral en la patogénesis de la recombinación.